Incubatie is de periode na de inoculatie. In deze periode geef je sporen de tijd om te ontkiemen en het substraat te doorgroeien met mycelium.
Mycelium groeit het beste onder warme omstandigheden. Plaats het substraat daarom op een warme plek. Het mycelium van de meeste paddestoelen groeit het beste bij een temperatuur van ongeveer 28 – 30 graden C.
Voor op kleine schaal is een kast boven de koelkast een goede plaats. Een koelkast wordt aan de achterkant warm en deze warmte stijgt op. Op grotere schaal moet er al snel gedacht worden aan een thermostaat of andere verwarmingselementen. Bedenk wel dat substraat met mycelium ook warmte uit zichzelf produceert.
Tevens dient de incubatieruimte geheel donker te zijn. Een donkere ruimte versnelt de groei. Ook kan licht ervoor zorgen dat er voortijdig paddestoelen gaan groeien.